此外，取假手术组比拟，模子组小鼠正在中风后24小时表示出较着的神经功能妨碍，评分更高，并持续了3天（图2H）。此中，中风小鼠的对侧前肢的坐立、坐立姿态和步态周期显著添加，而摆动速度则显著下降（图2J-M）。相反，EESO给药和中性粒细胞耗竭逆转了神经功能评分和步态参数的变化，且150 mg/kg的EESO给药正在后期对步态参数的改善尤为显著。

　　目标：本研究旨正在切磋豨莶草乙醇提取物（EESO）对AIS后神经炎症毁伤的改善感化，并沉点研究其相关机制，出格是HMGB1驱动的中性粒细胞募集和中性粒细胞外圈套（NETs）的生成。

　　豨莶草乙醇提取物通过阻断HMGB1的RAGE取CD11b的彼此感化，减轻中风后中性粒细胞介导的神经毁伤？。

　　布景：缺血性中风是一种危及生命的脑血管疾病，医治选择无限。正在急性缺血性中风（AIS）的进展过程中，由高迁徙率族卵白1（HMGB1）介导的中性粒细胞参取的炎症显著加剧了神经毁伤。豨莶草（Siegesbeckia orientalis L。，SO）是豨莶草药材的次要来历之一，正在抗神经炎症和调理中性粒细胞功能方面具有潜力。因而，猜测SO可能对AIS后的神经炎症毁伤具有感化。

　　成果：EESO给药显著减轻了光化学的小鼠AIS，表示为较着削减梗死体积，改善脑血流和神经功能。此外，EESO给药显著减轻了继发性神经毁伤，了中性粒细胞浸湿和NETs生成，并降低了血清促炎介质和HMGB1的程度。体外尝试中，含EESO血清中的化合物间接取神经源性HMGB1彼此感化。通过RAGE-CD11b彼此感化，HMGB1驱动的中性粒细胞迁徙和NETs生成被含EESO血清给药逆转。此外，异欧前胡素（isoimperatorin）、4，7-二甲基四氢萘-1-酮、荆芥内酯（perillartine）和达芦根醇（darutigenol）做为活性成分，对HMGB1驱动的中性粒细胞迁徙和NETs生成具有感化。

　　通过苏木精-伊红（H&E）染色和尼氏染色（Nissl’s staining）清晰地展现了神经毁伤的范畴和程度（图3A和C）。脑缺血后，模子组察看到从大脑皮层延长至海马区的受损区域。同时，模子组的尼氏小体外形犯警则、分布散正在且数量显著少于假手术组，表白中风小鼠存正在较着的神经毁伤。然而，EESO给药和中性粒细胞耗竭显著缩小了受损区域，此外，取假手术组比拟，中风后缺血半暗带中存正在持续性神经毁伤，表示为凋亡神经元（caspase 3阳性神经元）的存正在（图3B和D）。相反，EESO给药和中性粒细胞耗竭显著削减了凋亡神经元的数量。

　　如上所述，中性粒细胞耗竭显著改善了中风后的神经功能缺损，这可能归因于中性粒细胞浸湿和中性粒细胞外圈套（NETs）生成的削减。因而，进一步研究了EESO给药对中性粒细胞浸湿和NETs生成的影响。脑缺血导致梗死焦点和缺血半暗带中性粒细胞数量显著添加（图3E和G），这些细胞分布正在血管和脑本色中。此外，部门迁徙的中性粒细胞生成了NETs，这通过髓过氧化物酶（MPO）、瓜氨酸化组卵白H3（CitH3，NETs标识表记标帜物）和DAPI（双链DNA）的共定位得以，同时半暗带中MPO、PAD4和CitH3的表达程度升高（图3F和H）。比拟之下，150 mg/kg的EESO给药和抗Ly6G抗体处置显著减轻了中风后的脑中性粒细胞浸湿和NETs生成。

　　通过流式细胞术发觉，正在HMGB1感化后，中性粒细胞概况CD11b（Mac-1的α亚单元）的平均荧光强度（MFI）削弱（图5G），这可能取HMGB1驱动的中性粒细胞募集和激活过程中RAGE取CD11b之间的功能彼此感化相关。如预期所示，HMGB1感化后，取RAGE共沉淀的CD11b卵白程度显著添加（图5H），表白CD11b取RAGE之间的彼此感化加强。相反，EESO血清处置显著削减了HMGB1推进的CD11b取RAGE的共沉淀。进一步研究表白，含EESO血清、Azeliragon和抗CD11b抗体的处置显著了HMGB1驱动的中性粒细胞迁徙（图6B）。此外，含EESO血清的处置还通过降低MPO、PAD4和CitH3的卵白表达来NETs生成，其结果取Azeliragon和抗CD11b抗体处置类似（图6C-G）。这表白，通过阻断RAGE取CD11b之间的彼此感化，能够无效HMGB1驱动的NETs生成。

　　通过检测脑血流、梗死体积和神经功能来评估EESO对小鼠AIS的改善结果。如图2B-G所示，光化学毁伤导致小鼠左侧大脑半球呈现较着的血流削减和缺血性梗死。然而，取模子组比拟，EESO给药（75和150 mg/kg）以及通过打针Ly6G抗体耗竭中性粒细胞（阳性对照）显著恢复了脑血流灌注，并削减了梗死体积。

　　6、EESO通过阻断RAGE取CD11b的彼此感化HMGB1驱动的中性粒细胞迁徙和NETs生成。

　　鉴于SO的抗神经炎症和调理中性粒细胞的特征，本研究评估了SO乙醇提取物（EESO）对光化学的小鼠AIS的影响，并确定了其通过阻断RAGE-CD11b彼此感化来HMGB1驱动的中性粒细胞浸湿和NETs生成的机制。此外，还筛选并验证了EESO脱靶向HMGB1的潜正在活性成分。

　　响应地，除了芸喷鼻碱外，EESO的潜正在活性成分（包罗4，7-二甲基四氢萘-1-酮、荆芥内酯、异欧前胡素和达芦根醇）的处置显著削减了HMGB1驱动的中性粒细胞迁徙数量和发生NETs生成的中性粒细胞百分比（图8A-C）。值得留意的是，异欧前胡素正在这些化合物中对中性粒细胞迁徙和NETs生成的结果最为显著。此外，异欧前胡素处置显著阻断了HMGB1驱动的RAGE取CD11b之间的彼此感化，这通过共沉淀的CD11b程度降低得以（图8D）。异欧前胡素对NETs生成的感化还通过MPO和CitH3卵白表达程度的下调成果进一步支撑（图8E）。因而，被接收的活性成分，特别是异欧前胡素，对EESO靶向HMGB1阐扬了主要感化，通过阻断RAGE-CD11b彼此感化，减轻了中性粒细胞募集和NETs生成。

　　为了研究EESO给药能否通过HMGB1路子缓解中性粒细胞募集和NETs生成，我们成立了过表达HMGB1的N2a细胞系，并取中性粒细胞共培育。对于接管错配模仿转染的N2a细胞，氧糖（O）推进了神经元HMGB1的，随后导致中性粒细胞向下逛室迁徙和NETs生成。此外，O的HMGB1、中性粒细胞迁徙和NETs生成被10%的含EESO血清处置显著。风趣的是，取错配模仿转染比拟，O毁伤后过表达HMGB1的N2a细胞中，这些变化进一步加剧，表白神经元HMGB1间接推进了中性粒细胞迁徙和NETs生成。同时，因为对过表达HMGB1的N2a细胞中过量HMGB1的微弱影响，含EESO血清的处置未能逆转中性粒细胞迁徙和NETs生成（图5B-E）。如细胞热位移阐发（CETSA）成果显示（图5F），取空白血清组比拟，含EESO血清的处置显著加强了N2a细胞中HMGB1的热不变性（52-64°C），表白含EESO血清中存正在的某些化合物可以或许间接取神经元来历的HMGB1彼此感化。上述成果表白，EESO中的活性成分靶向HMGB1以中性粒细胞迁徙和NETs生成。

　　结论：本研究初次HMGB1通过推进CD11b取RAGE之间的彼此感化来驱动NETs生成。此外，EESO被靶向神经源性HMGB1，中性粒细胞浸湿和NETs生成，从而减轻中风后的神经炎症毁伤。这一感化归因于被接收进入血液的成分，包罗异欧前胡素、4，7-二甲基四氢萘-1-酮、荆芥内酯和达芦根醇。

　　中风凡是分为缺血性中风（IS）和出血性中风（HS），仍然是全球医疗保健的承担，具有高率和灭亡率。值得留意的是，70%~80%的中风患者被诊断为IS，这是因为短暂性或永世性脑动脉闭塞所致。包罗高血压、房颤、糖尿病、抽烟和久坐糊口体例正在内的浩繁要素会激发IS。迄今为止，虽然呈现了先辈手艺，但机械取栓和组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的静脉溶栓仍然是美国食物药品监视办理局（FDA）核准的急性缺血性中风（AIS）的常规医治选择。机械取栓的实施需要高程度的医疗设备和熟练的操做者，而静脉t-PA溶栓则对时间要求严酷（正在AIS发病后4。5小时内），而且容易呈现再通率低和出血，严沉了受益人群。

　　豨莶草（Sigesbeckiae Herba），也被称为“豨莶草”，是一种保守的中药，用于医治中风已无数百年汗青，如《本草纲目》中所记录。做为豨莶草药材的来历之一，豨莶草（Siegesbeckia orientalis L。，SO）富含倍半萜类和二萜类化合物，并具有优良的药理活性，特别是抗炎和神经感化。研究表白，SO的50%乙醇提取物对脂多糖（LPS）刺激的RAW264。7细胞中的炎症介质具有感化。利用D101大孔树脂制备的SO提取物给药表示出显著的抗神经炎症感化，并通过调理小胶质细胞功能和炎症细胞因子，缓解了手术的认知功能妨碍。此外，从SO平分离的喷鼻豆素类倍半萜内酯正在LPS刺激的人类中性粒细胞中了白细胞介素（IL）-1β和单核细胞趋化卵白-1（MCP-1）的发生，CD11b和CD62L的表达。

　　基于前面部门的研究成果，随后对EESO血清脱靶向HMGB1的潜正在活性成分进行了筛选。通过超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）阐发，判定出取空白组比拟具有显著差别的12种成分，包罗4，7-二甲基四氢萘-1-酮、 rutaecarpine（芸喷鼻碱）、perillartine（荆芥内酯）、isoimperatorin（异欧前胡素）、semilicoisoflavone B、phytolaccagenin（商陆素）、花生四烯酸（无过氧化物）、血根碱、(2S)-2-甲氧基库拉酮、虾青素、formononetin 7-O-葡萄糖醛酸苷和(-)-丁喷鼻树脂酚，这些是EESO正在血液轮回中被接收的次要成分（图7A-B）。此外，EESO的特征成分darutigenol（达芦根醇）和darutoside（达芦苷）也正在含EESO血清中被发觉。正在这些候选化合物中，4，7-二甲基四氢萘-1-酮、芸喷鼻碱、荆芥内酯、异欧前胡素和达芦根醇被预测为EESO脱靶向HMGB1的潜正在活性化合物，其连系能别离为6。25、5。4、4。98、4。87和4。41 kcal/mol（表2）。它们均取HMGB1的B-box布局域构成了氢键。配体-靶标复合物的三维和二维对接构象如图7C所示。

　　除了提高再通率外，神经元免受中风后继发性毁伤也至关主要。正在AIS的病理心理演变中，中缀的血液供应会导致神经元毁伤和潜正在坏死，随后发生神经元能量衰竭。除了梗死焦点中不成逆的神经元坏死外，梗死四周区域（半暗带）的神经元也会因炎症级联反映而履历可逆性毁伤。正在炎症细胞中，中性粒细胞被认为是被招募到缺血半球的“第一反映者”，并正在脑缺血后约2~3天达到峰值。此外，很多研究强调了中性粒细胞正在放大神经元毁伤中的环节感化。浸湿的中性粒细胞不只大量促炎介质，包罗卵白酶、细胞因子和趋化因子，还会正在特定刺激成中性粒细胞外圈套（NETs）。NETs是由去浓缩染色质和颗粒卵白粉饰的纤维收集，为促凝的粘附供给了支架，并推进了凝血级联反映。NETs的促凝潜力对血管再通形成了。此外，NETs的成分（如组卵白）会对临近神经元形成间接毁伤。因而，中性粒细胞浸湿和NETs生成是一种有前景的AIS医治策略。

　　研究通过小鼠光化学血栓栓塞性中风模子发觉，EESO通过中性粒细胞浸湿和NETs生成，显著改善了小鼠AIS模子的神经功能缺损和脑组织毁伤。其感化机制取靶向HMGB1、阻断RAGE-CD11b彼此感化亲近相关。此外，通过UPLC-MS和对接手艺，筛选出异欧前胡素、4，7-二甲基四氢萘-1-酮等活性成分，这些成分协同感化，HMGB1驱动的中性粒细胞迁徙和NETs生成。本研究不只了豨莶草正在中风医治中的保守使用价值，还了其潜正在的药理机制，为开辟新型神经剂供给了科学根据。

　　比来有报道称，AIS患者的轮回高迁徙率族卵白1（HMGB1）程度显著升高，并取功能预后不良亲近相关。细胞外HMGB1已被证明能够NETs，并将中性粒细胞招募到缺血半球，从而推进神经炎症毁伤。风趣的是，HMGB1驱动的中性粒细胞招募被证明依赖于巨噬细胞-1抗原（Mac-1，CD11b/CD18）取晚期糖基化终产品受体（RAGE）之间的彼此感化，而Mac-1-RAGE彼此感化会导致中性粒细胞中核因子-κB（NF-κB）的激活。然而，HMGB1触发的Mac-1取RAGE之间的彼此感化正在推进NETs生成中的感化尚待阐明。

　　中性粒细胞浸湿和NETs生成通过启动和放大脑部炎症反映，加剧了神经毁伤。因而，我们检测了相关的炎症目标。如预期所示，取假手术组比拟，模子组小鼠正在缺血半暗带中TNF-α和IL-1β的mRNA表达显著添加（图4A-B）。此外，取中性粒细胞浸湿相关的MCP-1和CXC趋化因子受体2（CXCR2）的mRNA程度正在光化学毁伤后也显著升高（图4C-D）。然而，150 mg/kg的EESO给药和中性粒细胞耗竭显著下调了中风后TNF-α、IL-1β、MCP-1和CXCR2的mRNA表达。值得留意的是，EESO给药还显著逆转了中风小鼠血清中HMGB1程度的升高（图4E）。免疫荧光染色成果也表白，受损神经元是中风后血清HMGB1的次要来历之一，表示为缺血焦点中缺乏HMGB1阳性的神经元，以及半暗带神经元中HMGB1向细胞质以至细胞外的转位（图4F）。EESO给药正在必然程度上减轻了HMGB1从神经元的转位和。因而，成果表白，EESO给药缓解了神经元来历的HMGB1和炎症目标的表达。

　　本研究聚焦缺血性中风（AIS）。鉴于神经功能恢复对预后的主要性，炎症激发的继发性神经毁伤备受关心。大都临床前神经剂临床结果欠安，而中药有临床医治中风劣势，豨莶草（SO）用于中风医治汗青长久。本研究切磋了豨莶草乙醇提取物（EESO）对急性缺血性中风（AIS）的感化及其机制。

　　方式：成立小鼠光栓塞中风模子，以评估EESO给药对AIS的改善结果。通过组织病理学查抄和免疫荧光染色察看脑神经毁伤、中性粒细胞浸湿和NETs的生成。此外，还通过qPCR和ELISA别离检测炎症目标和血清HMGB1程度。体外尝试中，评估了含EESO血清对中性粒细胞迁徙和NETs生成的影响。通过HMGB1过表达模仿转染、细胞热位移阐发和共免疫沉淀尝试，研究含EESO血清中的化合物能否靶向HMGB1以阻断晚期糖基化终产品受体（RAGE）取CD11b的彼此感化。此外，还筛选并验证了EESO脱靶向HMGB1的潜正在活性成分。